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色氨酸羥化酶（Th）ELISA 試劑盒

夾心法

夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:

1. 將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體

2. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結(jié)

3. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進行鍵結(jié)

4. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)

5. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果

色氨酸羥化酶（Th）ELISA 試劑盒

用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。當前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用廣。

過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應(yīng)的適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的大吸收光譜分別為275nm和403nm。

酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

純酶的RZ多在3.0以上，高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應(yīng)時的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃H2SO4終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時內(nèi)不改變,是目前國內(nèi)ELISA中常用的一種；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘黃色，大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍色，大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。

工作原理

本試劑盒采用雙位點夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），測定樣品中的水平。向預(yù)先包被抗體的酶標孔中加入標準品、待測樣本和HRP標記的抗體，經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的組分，然后再加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中的濃度呈正相關(guān)。